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Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 299 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Sechs Arten apikomplexer Parasiten der Gattung Babesia, nämlich B. microti, B. divergens, B. duncani, B. motasi, B. crassa–like und B. venatorum, gelten als die Hauptverursacher der endemischen Babesiose beim Menschen Bereiche. Diese sechs Arten besitzen unterschiedliche Virulenzgrade für ihre Hauptwirte. Daher ist die genaue Identifizierung dieser Arten von entscheidender Bedeutung für die Annahme geeigneter Therapiestrategien.

Wir haben einen Echtzeit-PCR-High-Resolution-Melting-Ansatz (qPCR-HRM) entwickelt, der auf das ribosomale 18S-RNA-Gen von fünf Babesia-Arten abzielt. basierend auf der Schmelztemperatur (Tm) und den prozentualen Werten der Genotyp-Konfidenz. Anschließend wurde dieser Ansatz anhand von 429 Blutproben von Patienten mit Zeckenbissen in der Vorgeschichte, 120 mit Plasmiden gemischten DNA-Proben und 80 im Labor infizierten Tierproben evaluiert.

Die Sensitivität und Spezifität der vorgeschlagenen qPCR-HRM-Methode betrugen 95 % bzw. 100 % und die Nachweisgrenze lag bei 1–100 Kopien des Plasmids mit dem klonierten Zielgen. Die Nachweisgrenze hing von der analysierten Babesienart ab. Die in dieser Studie entwickelten Primer stellten nicht nur die hohe interspezifische Spezifität unserer vorgeschlagenen Methode sicher, sondern auch eine hohe Vielseitigkeit für verschiedene Isolate derselben Art weltweit. Darüber hinaus eignet sich der aus dem vorbereiteten Plasmidstandard erhaltene Tm theoretisch zur Identifizierung von Isolaten aller bekannten Sequenzen der fünf Babesia-Arten.

Die entwickelte Nachweismethode stellt ein nützliches Werkzeug für die epidemiologische Untersuchung menschlicher Babesiose und das Prätransfusionsscreening dar.

Die menschliche Babesiose, die durch Babesia-Arten verursacht wird, bei denen es sich um Blutprotozoen der Familie Babesiidae (Ordnung Piroplasmida; Phylum Apicomplexa) [1] handelt, ist eine wieder auftretende, durch Zecken übertragene Krankheit. Fälle von durch Transfusionen übertragenen und natürlich erworbenen Babesia-Infektionen beim Menschen stellen ein ernstes Problem für die öffentliche Gesundheit dar und wurden in den letzten Jahren weltweit häufig gemeldet [2, 3]. Die für die Babesiose beim Menschen verantwortlichen Erreger werden vorwiegend über Zeckenstiche und Bluttransfusionen übertragen, seltener über perinatale Wege und Organtransplantationen [4,5,6,7,8]. Bisher wurden weltweit mehr als 100 Babesia-Arten identifiziert [9].

Babesia spp. Bisher ging man davon aus, dass sie nur Wild- und Haustiere infizieren. Allerdings wurde 1957 der erste Fall einer menschlichen Infektion mit Babesia in Jugoslawien gemeldet [10], und die Krankheit hat sich nach und nach zu einer neuen globalen parasitären Krankheit beim Menschen entwickelt, die möglicherweise eine Gesundheitsgefahr für Menschen mit schwächerem Immunsystem darstellt. Sechs Babesia-Arten, nämlich B. microti, B. venatorum, B. divergens, B. duncani, B. motasi und B. crassa-like, sind als die wichtigsten Krankheitserreger bekannt, die für die menschliche Babesiose verantwortlich sind (11, 12). Die meisten Babesia-Fälle in den USA werden durch B. microti verursacht, in Gebieten, in denen die Krankheit endemisch ist, aber auch B. duncani und B. divergens sind in den USA verbreitet [13]. In Europa kommt B. divergens hauptsächlich in Frankreich und Irland vor [12, 14], B. venatorum wurde in Österreich, Deutschland, Italien und Schweden gemeldet [14, 15, 16] und B. crassa-ähnliche Infektionen wurden gemeldet in Slowenien und Frankreich [17, 18]. In Asien werden B. venatorum und B. crassa-like hauptsächlich in China gemeldet [19, 20]. Allerdings wurden B. microti-Fälle im Südwesten Chinas entlang der Grenze zu Myanmar, Taiwan und Japan gemeldet [21,22,23,24,25]. Der Babesia motasi-Stamm KO1 (DQ3466955) ist in Korea verbreitet [12, 26]. Die Sequenzen von B. motasi KO1 und Babesia sp. KCDC-1 (MK930513)-Stämme, die aus zwei menschlichen Fällen in Südkorea isoliert wurden, zeigten große Ähnlichkeit mit der Sequenz des B. motasi hebeiensis-Stamms in China [26]. Es wurde auch beobachtet, dass B. duncani, das erstmals im US-Bundesstaat Washington gemeldet wurde, mittlerweile in Kanada weit verbreitet ist [27,28,29].

Menschen mit einem funktionierenden Immunsystem können nach einer Babesia-Infektion asymptomatisch bleiben, obwohl intermittierende und geringgradige Parasitämie gelegentlich > 2 Jahre andauern kann [30, 31]. Daher können mit Babesia infizierte Patienten, die keine Symptome zeigen, den Erreger über Bluttransfusionen oder Organtransplantationen auf andere übertragen [32]. In den USA werden parasitäre Infektionen im Zusammenhang mit Bluttransfusionen fast ausschließlich durch Babesien verursacht [33]. Es wurde auch beobachtet, dass eine durch Transfusionen übertragene Babesiose in etwa jedem fünften Fall zu schweren Komplikationen und zum Tod führt [30]. Allerdings gibt es in Gebieten mit menschlicher Babesiose-Epidemie immer noch keine Blutuntersuchung auf Babesiose oder sie wird nur in einer begrenzten Anzahl von Blutentnahmezentren durchgeführt [34].

Zu den derzeit zum Nachweis von Babesien (natürlichen Wirten und Tiermodellen) verwendeten Diagnosetechniken gehören mikroskopische Untersuchungen (ME), Immunoassays und molekulare Techniken [2]. Obwohl die traditionelle ME eine hohe Spezifität aufweist, zeichnet sie sich durch eine geringe Sensitivität aus und erfordert für die Durchführung der Analyse sehr erfahrene Mikroskopiker. Gängige molekulare Techniken wie der Nukleinsäurenachweis erbringen gute Ergebnisse, sind aber relativ zeitaufwändig, und einige bestehende Nukleinsäuretesttechniken zur Diagnose von Babesiose stellen hohe Anforderungen an die Instrumente [35,36,37]. Das immunologische Nachweisverfahren ist effizient, zeitsparend und empfindlich; Allerdings kommt es während des Nachweisprozesses häufig zu falsch positiven Ergebnissen aufgrund von Kreuzreaktionen, und es kann jeweils nur ein Erreger nachgewiesen werden. Der gleichzeitige Nachweis mehrerer Arten ist ein arbeitsintensiver Prozess, und die Unterscheidung aktueller Infektionen von früheren Infektionen mithilfe serologischer Tests ist immer noch eine Herausforderung [38, 39]. Während Echtzeit-PCR (qPCR)-basierte Techniken mit hoher Spezifität und Sensitivität für den Nachweis von Babesiose vorgeschlagen wurden, ist die Anzahl der Babesia-Arten, die mit dieser Technik gleichzeitig differenziell diagnostiziert werden können, begrenzt [40,41]. ,42,43]. Aktuelle Diagnosestrategien werden typischerweise zum Nachweis wichtiger Arten verwendet, insbesondere B. microti und B. divergens. Im Gegensatz dazu fehlen Methoden mit hoher Sensitivität und Spezifität für Arten mit geringer Prävalenz wie B. crassa-like und B. motasi [18]. Die tatsächliche Inzidenz und Verbreitung der Babesiose beim Menschen kann viel höher sein als die derzeit gemeldeten Werte [17, 44].

In Gebieten, in denen mehrere Babesia spp. Co-Endemien sind, ist die Differenzierung der Arten von entscheidender Bedeutung für die Steuerung einer angemessenen Behandlung und Überwachung. Zeckenüberträger übertragen häufig verschiedene Babesia-Arten, was in einigen Gebieten zum gleichzeitigen Auftreten mehrerer Arten von Babesia-Infektionen führt, was nicht nur große Schwierigkeiten bei der Prävention und Bekämpfung der daraus resultierenden Krankheiten und der Festlegung genauer Nachweismethoden mit sich bringt, sondern auch zu einer falschen Klassifizierung und einer schlechten Erkennung führt Tarife. Bemerkenswert ist, dass die Pathogenität und Reproduktionsfähigkeit von B. duncani denen von B. microti überlegen sind [45] und ersteres auch resistenter gegen derzeit empfohlene Anti-Babesia-Medikamente ist [46]. Daher sollten in Zukunft je nach Virulenz und Arzneimittelresistenz der Babesia-Arten unterschiedliche Behandlungsmethoden ausgewählt werden.

In dieser Studie haben wir einen qPCR-High-Resolution-Melting-Assay (qPCR-HRM) in einer einzigen Runde unter Verwendung eines einzelnen Primerpaars entworfen und die Leistung dieses Assays bei der gleichzeitigen Identifizierung von fünf zoonotischen Babesia-Arten untersucht, nämlich B. microti, B. divergens, B. duncani, B. motasi hebeiensis und B. crassa–like. Als Zielamplifikationsregion des qPCR-HRM wurde das 18S-ribosomale RNA-Gen (rRNA) ausgewählt, das die hochkonservierten und variablen Regionen von Babesia enthält. Die entwickelten Primer von HRM erlauben keine Kreuzreaktion mit anderen Zoonoseerregern, wie z. B. Toxoplasma gondii. Konkret basiert der HRM-Ansatz auf dem Prinzip, dass während der Dissoziation von doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA bei steigender Temperatur die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur (Tm) durch Überwachung der Fluoreszenz eines Farbstoffs erzeugt werden können die doppelsträngige DNA. Auf der Grundlage von Unterschieden in der Amplikonzusammensetzung der verschiedenen Arten können somit unterschiedliche Schmelzkurven, unterschiedliche Tm-Werte und unterschiedliche Werte für den Genotyp-Konfidenzprozentsatz (GCP) erhalten werden [47]. Es wurde berichtet, dass ein höherer GCP-Wert auf einen höheren Grad der Ähnlichkeit der Nukleinsäuresequenzen zwischen der Probe und der Positivkontrolle hinweist. Basierend auf unseren Ergebnissen kann dieser Test zur Differenzialdiagnose und epidemiologischen Untersuchung der Babesiose in Endemiegebieten eingesetzt werden.

Plasmide, die jeweils 18S-rRNA-Gensequenzen von B. microti (KF410825), B. divergens (FJ944826), B. duncani (HQ285838), B. motasi hebeiensis (DQ159074.1) bzw. B. crassa-like (AY260176) tragen , wurden als Positivkontrollen verwendet, um die Sensitivität und Spezifität der neu entwickelten qPCR-HRM-Nachweismethode zu bewerten. Die Plasmide mit einem klonierten Zielgen von B. microti Hebei oder B. divergens wurden von Tsingke Biotech Co. (Peking, China) synthetisiert. Die Stämme von B. motasi hebeiensis und B. duncani wurden vom Vectors and Vector-Borne Diseases (VVBD) Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute (LVRI), China, bezogen. Kurz gesagt, die PCR-amplifizierten Fragmente jedes Babesia-Stammes wurden mit dem Zymolean™ Gel DNA Recovery Kit (ZYMO Research Corp., Los Angeles, CA, USA) gereinigt und in den pGEM-T Easy-Vektor (Promega, Madison, WI, USA) kloniert. USA) und in kompetente Escherichia coli DH5α-Zellen transformiert (Takara Biotech Co., Ltd., Dalian, China). Anschließend wurden drei Klone aus jeder Probe ausgewählt und 12 Stunden lang in Luria-Bertani-Medium (3 ml) mit 100 μg/ml Ampicillin (Merck, Darmstadt, Deutschland) kultiviert. Anschließend wurde die Plasmidextraktion mit einem Plasmid Miniprep Kit (Axygen Scientific Inc., Union City, CA, USA) durchgeführt. Anschließend erfolgte die Sequenzierung mit dem Big Dye Terminator Mix (Genscript, Nanjing, China). Die Plasmidkonzentration wurde mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) gemessen. Die vorbereiteten Plasmide wurden dann mit enzymfreiem Wasser (Axygen Scientific Inc.) auf 107–10–1 Kopien/µl verdünnt.

Sechs Monate alte Schafe, die laut Mikroskopie und PCR negativ auf eine Piroplasmeninfektion wiesen, wurden im Kreis Jingtai, Provinz Gansu, China, gekauft (48). Einen Monat vor dem Experiment wurde bei den Schafen eine Splenektomie durchgeführt. Die Stämme von B. motasi hebeiensis und B. duncani wurden vom VVBD-Labor bezogen. Kurz gesagt, zur Vorbereitung der infizierten Tiere wurde eine Suspension von B. motasi hebeiensis, konserviert in flüssigem Stickstoff, schnell in Wasser bei 37 °C aufgetaut und ein 50-ml-Aliquot (ca. 1 × 109 infizierte Erythrozyten) dieser Lösung hinzugefügt wurde den Schafen über die Halsschlagader injiziert.

Syrische Hamster vom Typ Lakeview Golden (LVG) (Alter: 3 Monate) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Peking, China) gekauft. Ähnlich wie bei den infizierten Schafen wurden nach der schnellen Wiederbelebung von gefrorenem B. duncani in einem Wasserbad bei 37 °C fünf Hamster intraperitoneal mit 200 μl der B. duncani-Suspension (ca. 2,0 × 106 infizierte rote Blutkörperchen [iRBCs]) inokuliert ]).

4 bzw. 7 Tage nach der Impfung der Hamster und Schafe wurden Blutproben zur Vorbereitung von Abstrichen entnommen. Nach Giemsa-Färbung der Blutausstriche wurde von ME eine Parasitämie berechnet. Pro Blutausstrich wurden etwa 3000 Erythrozyten gezählt, um den Prozentsatz der parasitierten Erythrozyten zu berechnen. Wenn die Parasitämie im Bereich von 8 % bis 10 % schwankte, wurden Vollblutproben mit unterschiedlichen Parasitämiewerten in Röhrchen gesammelt, die das Antikoagulans Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielten. Aus 200 μl dieser Blutproben wurde die Gesamt-DNA mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit (QIAamp DNA Blood Mini Kit; Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

Die DNA von T. gondii und Trypanosoma evansi wurde aus dem Blut infizierter Tiere gewonnen, die im VVBD-Labor gesammelt wurden. In den Spezifitätsexperimenten wurde die DNA ohne jegliche Behandlung direkt als Matrize amplifiziert. Die Negativkontroll-DNA wurde aus Vollblut von gesunden Menschen, Schafen und piroplasmafreiem Zeckengewebe isoliert und mittels ME von Blutausstrichen und mittels Nested-PCR untersucht [48]. Zur Bestimmung der DNA-Konzentration wurde ein NanoDrop 2000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies) verwendet. Die extrahierte DNA wurde dann bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Diese Experimente wurden vom LVRI Tierethikkomitee der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Tierethikverfahren und -richtlinien der Volksrepublik China durchgeführt.

Die Plasmide mit einem klonierten Zielgen von B. microti oder B. divergens wurden in unterschiedlichen Konzentrationen zu DNA-Proben von gesunden Personen oder Zecken gegeben, um experimentell infizierte (positive) Kontrollproben herzustellen. Die Anzahl der hinzugefügten Plasmidkopien, um die positiven Proben zu erhalten, lag zwischen 1 und 104 Kopienzahl(en)/μl.

Es wurden Blutproben von 492 Patienten mit Zeckenstichen in der Vorgeschichte entnommen, die zwischen Mai 2017 und Juli 2019 das Zweite Krankenhaus der Lanzhou-Universität besucht hatten und in der tibetischen Autonomen Präfektur Gannan (Gansu, China) wohnten. Alle klinischen Proben wurden unter Verwendung genehmigter Protokolle und nach Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung jedes Patienten entnommen. Die Gesamt-DNA wurde aus 200 μl jeder klinischen Blutprobe mit dem QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) extrahiert.

Für diese Studie haben wir Primer mit hoher Spezifität zur Unterscheidung und Identifizierung von Babesia-Arten entwickelt. Die 18S-rRNA-Gensequenzen von fünf Babesia-Arten, die in verschiedenen Ländern auf der Grundlage der NCBI-Datenbank identifiziert wurden, wurden mit dem Softwarepaket DNAMAN 9.0 (Lynnon Biosoft, Vaudreuil-Dorion, QC, Kanada) und der Homologie der verschiedenen Isolate jeder Babesia-Art analysiert wurde mit der Software MEGA Version 7 analysiert. Die entsprechenden Fragmente derselben Babesia-Art aus verschiedenen Regionen, die eine Sequenzhomologie von 90–100 % aufwiesen, wurden herausgesucht. Es gab mehrere Unterschiede in der Basenlänge zwischen diesen gemeinsamen Fragmenten der fünf Babesia-Arten (Zusatzdatei 1: Abb. S1; Zusatzdatei 2: Abb. S2). Um die fünf Babesia-Arten zu unterscheiden, haben wir mit der Software Primer v.5.0 (PREMIER Biosoft, San Francisco, CA, USA) universelle Primer entwickelt, die auf gemeinsame Fragmente für die qPCR-HRM-Analyse abzielen.

Um sicherzustellen, dass die Primer gleichzeitig die Zielregionen des 18S-rRNA-Gens aller fünf Babesia spp. Ohne unspezifische Banden oder Primerdimere zu erzeugen, die beide die Interpretation der Ergebnisse in der nachfolgenden qPCR-HRM-Analyse beeinträchtigen würden, führten wir eine Reihe von Gradienten-PCR-Assays durch, um die optimale Annealing-Temperatur für die Primer zu bestimmen. Kurz gesagt, wurde der PCR-Mix (20 μl) vorbereitet, der die Premix-Taq-DNA-Polymerase (10 μl; Takara), die DNA-Matrize (1 μl), jeden Primer (10 μM/μl) und RNase-freies Wasser (7 μl) enthielt Anschließend wurde eine Gradienten-PCR mit einem T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) durchgeführt. Danach wurde die Mischung 2 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, gefolgt von 40 Zyklen Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, Tempern bei einem Temperaturgradienten von 54 °C bis 61 °C für 30 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 30 s, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Nach der Gradienten-PCR-Amplifikation wurden die Produkte durch Elektrophorese in 1,5 % (w/v) Agarosegelen aufgetrennt, um die Primerspezifität und Amplifikationseffizienz bei den verschiedenen Annealing-Temperaturen zu bewerten.

Die qPCR-Amplifikation wurde in einer 20-µl-Reaktionslösung durchgeführt, die die Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 nM), Forget-me-Not™ qPCR Master Mix (10 µl; Biotium, Hayward, CA, USA), 40× Template-Puffer ( 0,5 μl), RNase-freies Wasser (6,5 μl) und die DNA-Probe (1 μl). Die qPCR-HRM-Assays wurden unter Verwendung eines Rotor-Gene Q6000 Real-Time PCR-Systems (Qiagen) mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und 55 °C für 30 s. HRM wurde von 75 °C bis 85 °C in einem Schritt von 0,2 °C mit einer Haltezeit von 2 Sekunden bei jedem Erfassungsschritt durchgeführt. Abschließend wurden die Testergebnisse mit dem Programm High-Resolution Melt Software v.2.3.1 (Qiagen) analysiert, das automatisch die Schmelzkurve, Tm- und GCP-Werte generiert.

Die Spezifität des Assays wurde unter Verwendung von 20 ng/μl Plasmiden mit einem geklonten Zielgen zoonotischer Babesien, einschließlich von B. divergens, B. motasi hebeiensis, B. crassa–like, B. duncani und B. microti, mit den Proben bewertet verdünnt durch DNA, die aus Blutproben gesunder Menschen extrahiert wurde, um sicherzustellen, dass ein Primerpaar zur genauen Unterscheidung der fünf Babesia-Arten verwendet werden kann. in einer einzigen Reaktion. Für jedes Plasmid wurden fünf Replikate hergestellt und die Standard-Tm- und GCP-Werte jedes Babesia-Stammes wurden auf der Grundlage von fünf unabhängigen qPCR-HRM-Experimenten erhalten. Die Spezifität dieses Assays wurde auch anhand der aus anderen Organismen wie T. gondii, T. evansi, Zecken und Hamstern extrahierten DNA bewertet. Als Negativkontrolle wurde genomische DNA verwendet, die aus Vollblut gesunder Menschen extrahiert wurde.

Die analytische Sensitivität wurde anhand zehnfacher Reihenverdünnungen der fünf Plasmid-DNA-Standards im Bereich von 1 bis 107 Kopienzahl(en)/μl bewertet. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, um die Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Anschließend wurden Standardkurven mit der High-Resolution Melt-Software v.2.3.1 (Qiagen) aufgezeichnet, um die Effizienz des Assays zu bewerten.

Die Leistung des qPCR-HRM-Assays wurde anhand von Standard-Positivproben (experimentell infizierte Tierproben, DNA-Proben gemischt mit Plasmiden und Plasmiden) sowie klinischen Proben bewertet (Tabelle 1). Das Vorhandensein von B. duncani und B. motasi hebeiensis in den entnommenen Blutproben wurde mikroskopisch nachgewiesen. Mit der zuvor etablierten Nested-qPCR-Methode zum spezifischen Nachweis von B. duncani wurden 80 mit Plasmiden gemischte DNA-Proben und 80 im Labor infizierte Tierproben nachgewiesen und die Nachweisleistung mit dem qPCR-HRM-Assay zum Nachweis von B. duncani verglichen. Insgesamt 492 klinische Proben, 120 mit Plasmiden gemischte DNA-Proben und 80 im Labor infizierte Tierproben wurden ebenfalls randomisiert, neu gekennzeichnet und mithilfe der qPCR-HRM-Methode blind nachgewiesen. Gleichzeitig wurden die qPCR-Produkte aller Proben mit einem Gel-Recovery-Kit gereinigt und eine 18S-rRNA-Gensequenzierung durchgeführt, um die qPCR-HRM-Ergebnisse zu verifizieren.

Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde mit der SPSS-Software (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt, um zu analysieren, ob es signifikante Unterschiede in den Tm-Werten der fünf Babesia-Arten gab. Die Tm-Werte von B. crassa-like und B. motasi hebeiensis wurden durch Durchführung eines T-Tests weiter analysiert.

Ein Paar universeller Primer (Babesia-3F: 5′-ACG AGA CCT TAA CCT GCT AA-3′, Babesia-3R: 5′-CAC AGA CCT GTT ATT GCC TTA-3′) wurde ausgewählt, um die lokalisierte Zielsequenz zu amplifizieren im 18S rRNA-Gen der Babesia spp. durch Screening mehrerer Primerpaare (Abb. 1). Laut der BLAST-Analyse (Basic Local Alignment Search Tool) der Primer variierte die Länge der PCR-Produkte zwischen 118 und 127 bp. Die Upstream- und Downstream-Primer zielen auf die konservierten Regionen auf beiden Seiten der hypervariablen V3-Region des 18S-rRNA-Gens von Babesia spp. ab und ermöglichen so eine Artendifferenzierung mittels Schmelzkurvenanalyse. Bei einer Glühtemperatur von 55 °C erhaltene Elektrophoreseergebnisse zeigten das Auftreten einer starken Bande ohne eine unspezifische Bande in der Negativkontrolle (Zusatzdatei 3: Abb. S3).

Sequenzvergleich gemeinsamer Sequenzen von fünf Babesia-Arten. durch die in dieser Studie verwendeten Universalprimer verstärkt. Die Sequenz für die konservierte Region der 18S-rRNA, die Babesia spp. gemeinsam ist. wird rot angezeigt. Die Sequenz für die 18S-rRNA-Variantenregion, die Babesia spp. gemeinsam ist. wird blau angezeigt. Der weiße Teil ist die differenzielle Basis der 18S-rRNA der fünf Babesia-Arten. Punkte stellen die Base dar, die in dieser Region des Stammes im Vergleich zu anderen Arten fehlt. rRNA, Ribosomale RNA

Der qPCR-HRM-Assay unterschied erfolgreich alle fünf Babesia-Arten. in dieser Studie berücksichtigt. Insbesondere konnte, wie in Abb. 2 dargestellt, die Schmelzkurve verschiedener Babesia-Arten klar getrennt und der Tm jeder Art bestimmt werden. Für DNA-Proben, die nicht zu Babesia-Erregern gehören, wurden keine Schmelzkurven beobachtet. Darüber hinaus zeigte die Negativkontrolle, die die Hintergrund-DNA des Wirts enthielt, keine Amplifikation. Somit könnten die erhaltenen Tm- und GCP-Werte als Referenzstandards für die Identifizierung von Babesia spp. verwendet werden. (Tabelle 2). Die Babesia-Arten wurden auch anhand von Ähnlichkeiten in Standardkurven und Tm-Werten zwischen den analysierten Proben und Referenzproben identifiziert.

Erkennung und Unterscheidung der fünf Babesia-Arten. a Rohdaten aus der Schmelzkurvenanalyse, b normalisierte HRM-Diagramme für 18S-rRNA-Amplikon, c normalisierte Differenzkurven, d Ableitungsdiagrammanalysen. Die Schmelzkurve und Tm für jede Art sind sehr gut zu erkennen. HRM, hochauflösendes Schmelzen; Tm, Schmelztemperatur

Die Nachweisgrenze des qPCR-HRM-Assays wurde anhand zehnfach seriell verdünnter Plasmid-DNA-Proben der fünf Babesia-Arten ermittelt. in drei unabhängigen Reaktionen, wobei die Konzentrationen zwischen 1 und 107 Kopien/µl lagen. Die Nachweisgrenze des Assays für B. microti lag bei einer Kopie, während sie für B. divergens und B. duncani bei 10 Kopien lag. Sowohl B. motasi hebeiensis als auch B. crassa–like konnten bereits bei 100 Kopien der Zielsequenz nachgewiesen werden (Abb. 3).

Abgeleitete Schmelzkurve von Babesia-Plasmiden mit zehnfacher Reihenverdünnung. a B. duncani, b B. microti, c B. divergens, d B. crassa-like, e B. motasi hebeiensis

Die Unterscheidungskraft dieses Assays wurde mithilfe eines Blindtests bewertet, der 200 Babesia-positive Proben (DNA-Proben gemischt mit Plasmiden und im Labor infizierten Tierproben) und 492 klinische Proben umfasste. Die beobachtete Sensitivität und Spezifität des qPCR-HRM-Assays betrugen 95 % bzw. 100 %. In klinischen Proben von Patienten mit Zeckenstichen in der Vorgeschichte wurden vier B. divergens-Exemplare nachgewiesen (Tabelle 3). Die Ergebnisse zeigten auch, dass der qPCR-HRM-Ansatz zum Nachweis von Babesien in verschiedenen Wirtsproben wie Zecken, Menschen und Nagetieren verwendet werden kann und keine Kreuzreaktion mit der Wirts-DNA beobachtet wurde. Darüber hinaus wurden Proben mit unterschiedlichen Plasmidkopiezahlen von Babesia erfolgreich nachgewiesen. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass der qPCR-HRM-Assay das 18S-rRNA-Gen von Babesia spp. spezifisch amplifizieren kann. Die Schmelzkurven der aus verschiedenen Chargen extrahierten DNA-Proben zeigten eine hohe Wiederholbarkeit, und obwohl es eine leichte Änderung der Tm-Werte gab, wurde keine Änderung der Form des Schmelzpeaks oder des Tm-Abstands zwischen den Proben beobachtet. Die Ergebnisse der einfaktoriellen ANOVA zeigten signifikante Unterschiede im Tm zwischen den fünf Babesia-Arten. (p < 0,0001), was hinreichend zeigt, dass der qPCR-HRM-Ansatz zur klaren Unterscheidung von Babesia-Arten verwendet werden kann. Bei der Schmelzkurvenanalyse lag der GCP-Wert der automatischen Analyseergebnisse bei 90–100 %, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass die Ergebnisse der Artendifferenzierung recht überzeugend sind.

Auch wenn die von den Zielsequenzen von B. crassa-like und B. motasi hebeiensis erzeugten Tm relativ ähnlich waren, konnten diese Arten dennoch klar unterschieden werden, da der aus dem t-Test erhaltene p-Wert zwischen ihren Tm-Werten < 0,0001 betrug . Darüber hinaus konnten B. crassa–like und B. motasi hebeiensis anhand der Form der Schmelzkurven der gemischten Proben unterschieden werden. Das qPCR-Produkt des Plasmidstandards von B. crassa-like wurde mit den qPCR-Produkten von DNA-Proben von B. crassa-like oder B. motasi hebeiensis in einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt. Die HRM-Analyse wurde wiederholt und es wurde beobachtet, dass die Schmelzkurve von B. motasi hebeiensis einen Doppelpeak bildete, während die von B. crassa-like einen unimodalen Peak bildete (Abb. 4).

Differentialdiagnose von B. crassa-like und B. motasi hebeiensis. 1C PCR-Produkt des Plasmids von B. crassa-like, 2C PCR-Produkt des Plasmids von B. motasi Hebei, 1 gemischte Probe von PCR-Produkten von Plasmid und DNA von B. crassa-like, 2 gemischte Probe des PCR-Produkts von B. motasi hebeiensis-DNA und PCR-Produkt des B. crassa-ähnlichen Plasmids. Das qPCR-Produkt des Plasmids von B. crassa-like wurde mit den qPCR-Produkten zweier unbekannter Babesia-Proben in einem Volumen von 1:1 gemischt und anschließend eine HRM-Analyse durchgeführt

Die Fähigkeit unserer neu entwickelten Methode zum Nachweis von B. duncani wurde durch Vergleich mit den Ergebnissen der Mikroskopie und der verschachtelten qPCR unter Verwendung von 120 mit Plasmiden gemischten DNA-Proben und 80 im Labor infizierten Tierproben bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass unsere vorgeschlagene Methode, qPCR-HRM, eine gute Leistung beim Nachweis von B. duncani zeigt (Tabelle 4).

In den letzten Jahrzehnten kam es zu einem allmählichen Anstieg der Fälle menschlicher Babesiose, was vor allem auf verstärkte menschliche Aktivitäten in den Babesiose-Endemiegebieten, ein unzureichendes öffentliches Bewusstsein für menschliche Babesiose, die Ausweitung der Verbreitung wichtiger Zeckenüberträger und den Klimawandel zurückzuführen ist. Bestehende Technologien für Babesia spp. Die Erkennung unterliegt mehreren Einschränkungen [44]. Derzeit ist ME der Goldstandard für die Bestätigung einer Babesiose-Infektion [49], aber mehrere Babesia spp. die Menschen infizieren, ähneln Plasmodium nicht nur morphologisch, sondern auch untereinander [2]. Der erhaltene niedrige Parasitämiewert kann dazu führen, dass diese Proben während ME fälschlicherweise als falsch negativ diagnostiziert werden [50]. Es stehen mehrere PCR-basierte Tests zum Nachweis von Babesia zur Verfügung, wie zum Beispiel die digitale Tröpfchen-PCR, cobas® Babesia (Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA) und ein lizenzierter Nukleinsäuretest, der auf das Babesia 18S-rRNA-Gen abzielt [35, 36,37]. Obwohl diese Methoden eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität aufweisen und zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Krankheitserreger verwendet werden können, besteht ein großer Nachteil, der ihre Anwendbarkeit in Ländern mit Babesiose-Endemie einschränkt, darin, dass sie komplexe und teure Instrumente erfordern. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung kann auch zum Nachweis aktiver Infektionen eingesetzt werden; Allerdings hat diese Methode bei der Erkennung von Hypoparasitämie in den frühen Stadien der Infektion eine begrenzte Leistung gezeigt [51]. Immunfluoreszenz-Assays, enzymgebundene Immunosorbens-Assays und Multiplex-Bead-Format-Assays können ebenfalls zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, die innerhalb einer Woche nach der Infektion produziert werden. Allerdings sind die von mehreren Babesia spp. produzierten Antikörper vorhanden. im Wirt scheinen unterschiedlich zu sein und daher sind mehrere Analysen erforderlich, um eine Babesia-Infektion auszuschließen, was ein mühsamer Prozess ist [52, 53]. Babesia-Antikörper sind in der Regel noch mehrere Monate nach dem Abklingen der Infektion im Blut nachweisbar, und die Unterscheidung zwischen aktuellen und früheren Infektionen ist immer noch schwierig [50, 54, 55]. Darüber hinaus umfassen diese oben genannten Diagnosemethoden nicht den spezifischen Nachweis von B. crassa–like und B. motasi hebeiensis; Sie eignen sich daher nicht für die spezifische Diagnose und epidemiologische Untersuchung dieser Arten. Daher ist es notwendig, eine leistungsstarke Technik zu entwickeln, die die Möglichkeit bietet, mehrere Babesia-Arten gleichzeitig nachzuweisen.

Im Vergleich zu anderen molekulardiagnostischen Methoden bietet qPCR-HRM mehrere Vorteile, nämlich niedrige Kosten, hohe Genauigkeit und Schnelligkeit; die gleichen Vorteile wie multiple qPCR basierend auf der Verwendung artspezifischer Sonden; und zur Analyse der PCR-Produkte ist keine Sequenzierung oder Gelelektrophorese erforderlich, wodurch eine mögliche Laborkontamination der PCR-Produkte vermieden wird [56]. In einigen Studien wurde die HRM-Technologie zum Nachweis von Krankheitserregern eingesetzt und es wurde beobachtet, dass HRM, das auf das 18S-rRNA-Gen abzielt, eine äußerst zuverlässige Strategie zum Nachweis und zur Differenzierung von Arten darstellt. Bakheit et al. unterschied Theileria equi und Babesia caballi von HRM [57], Chua et al. erforschten HRM als Technik zum gleichzeitigen Nachweis von fünf Plasmodium-Arten, die Menschen infizieren [58], und kürzlich haben Keatley et al. führten eine Identifizierung von Trypanosomeninfektionen in australischen Wildtieren auf Artenebene durch [59]. Rojas et al. verwendeten auch HRM-qPCR, um Spirocercalupi in Stuhlproben von Hunden mit Spirozerkose nachzuweisen und zu quantifizieren [60]. Darüber hinaus haben Wang et al. verwendeten HRM, um vier Babesia-Arten zu unterscheiden, die Rinderbabesiose verursachen [47]. Der von Bielicka et al. entwickelte mPCR-HRM-Assay. bietet auch die Möglichkeit, B. microti, B. divergens, B. venatorum und B. canis nachzuweisen, erfordert jedoch drei Primerpaare für mehrere Reaktionen [61], was zeitaufwändiger ist als die hier vorgeschlagene Methode. Der Zeitaufwand für die Analyse einer Probe mit der hier beschriebenen qPCR-HRM-Methode, einschließlich Amplifikationskurvenerkennung und Schmelzkurvenanalyse, betrug 1 Stunde und 10 Minuten. Die zuvor gemeldeten Unterscheidungskriterien für HRM sind Tm und Schmelzkurve. Zusätzlich zu diesen beiden Kriterien haben wir in dieser Studie den GCP-Wert zur Hilfsidentifikation verwendet.

Da der Tm-Unterschied direkt mit Unterschieden in der Sequenz der gesamten Zielregion zusammenhängt, führt eine Änderung des Tm-Werts und der Form der Schmelzkurve zu einer Fehlidentifizierung der Zielspezies. In dieser Studie sorgten HRM-Primer für ausreichende Tm-Unterschiede zwischen den fünf Babesia-Arten. Für eine zuverlässige Unterscheidung gelten Tm-Werte > 0,25 °C als Hinweis auf verschiedene Arten [47]. Die Amplikons von B. duncani und B. motasi hebeiensis weisen mit einem Unterschied von etwa 1,7 °C den niedrigsten bzw. höchsten Tm auf. Es gab keine Überschneidung zwischen dem Tm-Bereich und den Schmelzkurveneigenschaften der fünf Babesia-Arten, die durch HRM-Analyse genau unterschieden werden konnten. Angesichts der Praktikabilität des qPCR-HRM bei der Diagnose von Babesiose gewährleisten die entwickelten Primer eine hohe interspezifische Spezifität der Methode. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den verschiedenen Isolaten erwies sich der aus dem vorbereiteten Plasmidstandard erhaltene Tm außerdem als anwendbar für die Unterscheidung aller bekannten Sequenzen der Zielspezies. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass diese Methode für verschiedene Isolate derselben Art weltweit äußerst vielseitig ist. Während der Schmelzkurvenanalyse betrug der GCP der automatisch aufgerufenen Ergebnisse 90–100 %, und der GCP lieferte starke Unterstützung für die Ergebnisse der Artenunterscheidung.

Wilson et al. verwendeten eine digitale Tröpfchen-PCR zur Unterscheidung zwischen B. microti und B. duncani, eine Methode, mit der 10 Genkopien in einem Reaktionsvolumen nachgewiesen werden können [35]. Allerdings lag die Nachweisgrenze unserer neu entwickelten qPCR-HRM-Methode bei einer Kopie für B. microti und 10 Kopien für B. duncani. Stanley et al. verwendeten cobas Babesia (Roche Molecular Systems, Inc.) zum Nachweis von B. duncani, B. microti, B. divergens und B. venatorum, und die Nachweisgrenzen für diese vier Babesia-Arten lagen Berichten zufolge zwischen 6,1 und 50,2 iRBCs/ml [ 36]. Da jedoch die Anzahl der DNA-Kopien die Zieleinheit des qPCR-HRM-Nachweises ist, können die Ergebnisse der vorliegenden Studie nicht mit der Empfindlichkeit der von Stanley et al. entwickelten Bestimmung verglichen werden. unter Verwendung von iRBCs/ml als Maßeinheit.

Die klinische Nachweisleistung des qPCR-HRM-Assays wurde anhand klinischer Proben und im Labor infizierter Tierproben bewertet. Die Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass der Test die gleiche Fähigkeit zur genauen Diagnose von Babesien bietet wie derzeit verfügbare Techniken. In klinischen Proben von Patienten mit Zeckenstichen in der Vorgeschichte wurde eine Babesia divergens-Infektion festgestellt. Dies steht im Einklang mit den zuvor von Wang et al. berichteten Ergebnissen. basierend auf der Verwendung von Nested PCR [48]. Die Nachweisergebnisse von Blutproben von mit B. duncani infizierten Hamstern zeigten, dass die Empfindlichkeit der qPCR-HRM-Methode zum Nachweis von B. duncani deutlich höher war als die der Mikroskopie und die Nachweisleistung mit der von Nested-qPCR vergleichbar war. Mit der qPCR-HRM-Methode können nicht alle Zielsequenzen von Proben erfolgreich amplifiziert werden, was von der Empfindlichkeit der Diagnosemethode abhängt. In Anbetracht der Tatsache, dass DNA-Proben nur aus 200 μl Blut extrahiert wurden, kann dies zu falsch negativen Ergebnissen führen, wenn die Parasitämie in diesen Proben extrem niedrig ist oder die DNA-Extraktion unsachgemäß durchgeführt wird. Auch wenn der qPCR-HRM-Diagnosetest relativ empfindlich ist, ist die DNA-Extraktion daher ein Schlüsselfaktor für die Bestimmung der diagnostischen Genauigkeit.

Ungeachtet der Vorteile der hier vorgeschlagenen Methode weist sie einige Einschränkungen auf. Es ermöglicht beispielsweise keinen quantitativen Nachweis. Eine weitere Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass weniger Proben von Babesia-Fällen beim Menschen gesammelt wurden und es an Leistungsdaten zur Anwendbarkeit des entwickelten qPCR-HRM-Assays in der klinischen Praxis mangelte. Zukünftig wird es notwendig sein, diese Technologie zu optimieren, beispielsweise durch die Hinzufügung artspezifischer molekularer Sonden, um eine höhere Spezifität und einen Nachweis mit positiveren klinischen Proben zu gewährleisten.

Der in dieser Studie entwickelte qPCR-HRM-Assay ist ein vielversprechendes Werkzeug zur gleichzeitigen Identifizierung von fünf humaninfizierenden Babesia-Arten. mit nur einem Primerpaar. Diese Strategie stellt eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden dar, die sich durch eine geringe Erkennungsleistung auszeichnen und nur einzelne Arten erkennen können. Dieser Test kann eine praktische und potenzielle Alternative für die schnelle und genaue Diagnose einer Babesia-Infektion sein, da er auch die Möglichkeit bietet, Arten mit geringer Prävalenz zu erkennen, wie z. B. B. crassa-like und B. motasi hebeiensis. Darüber hinaus kann der vorgeschlagene qPCR-HRM-Assay auch für die Blutuntersuchung eingesetzt werden, insbesondere in Gebieten, in denen Babesiose endemisch ist.

Alle in dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind im veröffentlichten Artikel enthalten. Alle Autoren stellen Daten zur Veröffentlichung zur Verfügung.

Hochauflösendes Schmelzen

Prozentsatz der Genotyp-Konfidenz

Lanzhou Veterinärforschungsinstitut

Mikroskopische Untersuchung

Echtzeit-PCR

Schmelztemperatur

Durch Transfusion übertragene Babesiose

Labor für Vektoren und durch Vektoren übertragene Krankheiten

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Unzutreffend.

Diese Studie wurde finanziell durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2022YFD1800200), der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31972701, Nr. 32060231) und des Science Fund for Creative Research Groups der Provinz Gansu, China, unterstützt (22JR5RA024), Natural Science Foundation of Gansu, China (21JR1RA138, 22JR5RA031, 22CX8NA011), das Agricultural Science and Technology Innovation Program, China (ASTIP) (CAAS-ASTIP-2016-LVRI), NBCIS (CARS-37), National Parasitic Resources Center, China (NPRC-2019–194-30), der Leading Fund des Lanzhou Veterinary Research Institute, China (LVRI-SZJJ-202105) und das Brutprogramm des State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, China (SKLVEB2021CGQD02).

Yanbo Wang und Shangdi Zhang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen und teilen sich die Erstautorenschaft.

Staatliches Schlüssellabor für die Kontrolle und Prävention von Tierkrankheiten, Schlüssellabor für Veterinärparasitologie der Provinz Gansu, Veterinärforschungsinstitut Lanzhou, Chinesische Akademie für Agrarwissenschaften, Lanzhou, Gansu, Volksrepublik China

Yanbo Wang, Xiaoyun Li, Yueli Nian, Junlong Liu, Hong Yin, Guiquan Guan und Jinming Wang

Das Zweite Krankenhaus der Lanzhou-Universität, Lanzhou, Volksrepublik China

Yanbo Wang, Shangdi Zhang, Yueli Nian und Xinyue Liu

Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou University, Yangzhou, 225009, China

Hong Yin

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Wang Jinming und Wang Yanbo haben die Studie konzipiert und überwiegend daran teilgenommen. Zhang Shangdi, Li Xiaoyun und Nian Yueli führten Probenentnahmen und Experimente durch. Wang Yanbo schrieb das Manuskript; Die anderen Autoren führten eine Datenanalyse durch. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Entsprechung zu Hong Yin, Guiquan Guan oder Jinming Wang.

Die Entnahme und Manipulation von Hamsterblutproben wurde von der Tierethikkommission des Lanzhou Veterinary Research Institute der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften genehmigt. Alle Probenahmeverfahren wurden gemäß den Tierethikverfahren und -richtlinien der Volksrepublik China (Zulassungsnummer LVRIAEC-2020–001) durchgeführt. Experimente mit klinischen Proben wurden von der Ethikkommission des Zweiten Krankenhauses der Universität Lanzhou genehmigt (Genehmigungsnr. 2018A-046) und alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Verfahren und Richtlinien der Volksrepublik China durchgeführt.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Alle Autoren stimmen der Veröffentlichung dieses Manuskripts zu.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Sequenzausrichtung und Homologieanalyse von fünf in verschiedenen Regionen veröffentlichten Babesia-Isolaten. Die beiden Enden der gemeinsamen Sequenz sind die Bindungsstellen der Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer. a, B. duncani; b, B. microti; c, B. divergens; d, B. crassa-artig; e, B. motasi hebeiensis.

Informationen zu Babesia-Isolaten aus verschiedenen Regionen, die für das Sequenz-Alignment verwendet wurden. a, B. duncani; b, B. microti; c, B. divergens; d, B. crassa-artig; e, B. motasi hebeiensis.

Bewertung der Primereffizienz bei verschiedenen Glühtemperaturen. a, 54 °C; b, 55 °C; c, 56 °C. Spuren: M, Markierung; 1, B. duncani; 2, B. microti; 3, B. divergens; 4, B. crassa-artig; 5, B. motasi hebeiensis; C, Negativkontrolle.

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Wang, Y., Zhang, S., Li, X. et al. Ein hochauflösender Schmelzansatz zur gleichzeitigen Differenzierung von fünf humanen Babesiose-verursachenden Babesia-Arten. Parasites Vectors 16, 299 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05839-5

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Eingegangen: 28. Dezember 2022

Angenommen: 16. Juni 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05839-5

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