Entwicklung quantitativer Multiplex-RT - Ningbo Assembly Hospital Inc.

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12073 (2023) Diesen Artikel zitieren

299 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Hepatitis Delta ist eine Krankheit, die durch die Exposition gegenüber den Viren Hepatitis B (HBV) und Hepatitis D (HDV) verursacht wird und im Vergleich zu einer HBV-Monoinfektion normalerweise einen schwerwiegenderen klinischen Ausgang hat. Bisher wird die tatsächliche Prävalenz einer HDV-Infektion unterschätzt und es sind nur wenige Nachweismethoden verfügbar, insbesondere in endemischen Regionen. Daher wurde eine einstufige RT-qPCR-Methode zur Quantifizierung von HDV-RNA entwickelt. Biologische Proben wurden zwischen 2017 und 2023 von Patienten im Ambulatório Especializado em Hepatites Virais des Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia und Serviço de Assistência Especializada ausgewählt und dem in dieser Studie entwickelten Test und einem zweiten quantitativen RT-qPCR-Assay unterzogen. Die Steigung des anfänglichen quantitativen Tests betrug –3,321 mit einer Effizienz von 100,04 % und einem Amplifikationsfaktor von 2. Die Analyse der Wiederholbarkeitsdaten ergab eine Quantifizierungsgrenze von 5 Kopien/Reaktion und eine Nachweisgrenze (95 %) von 2,83 Kopien pro Reaktion. Bei den diagnostischen Sensitivitätstests wurde eine Genauigkeit von 97,37 % im Vergleich zum Referenztest erreicht. Dieser Test erwies sich als äußerst effizient und reproduzierbar und machte ihn zu einem wertvollen Instrument zur Überwachung von Hepatitis-Delta-Patienten und zur Beurteilung des Risikos eines Fortschreitens der Krankheit sowie der Wirksamkeit der Behandlung.

Das in die Gattung Deltavirus eingeordnete Hepatitis-Delta-Virus (HDV) ist atypisch und weist etwa 1.700 Nukleotide eines Einzelstrangs RNA mit negativer Polarität mit einer Größe zwischen 36 und 43 nm auf und weist in seiner äußeren Struktur Oberflächenproteine des Hepatitis-B-Virus (HBV) auf )1,2. Einer HDV-Infektion geht eine vorherige Exposition, eine aktuelle oder gleichzeitige Infektion mit HBV voraus. Normalerweise ist das klinische Ergebnis schwerwiegender und im Vergleich zu einer HBV-Monoinfektion durch ein beschleunigtes Fortschreiten einer Zirrhose oder eines hepatozellulären Karzinoms gekennzeichnet3,4,5.

Es ist derzeit schwierig, die Prävalenz von HDV weltweit genau abzuschätzen; Mindestens 12 bis 15 Millionen Menschen könnten mit dem Virus infiziert sein, verteilt über Afrika, Asien, Amerika, den östlichen Mittelmeerraum und Europa6,7. In Südamerika liegt das Endemiegebiet für HDV im Norden (Amazonasbecken) und umfasst mehrere Länder5,8,9,10. In Brasilien lag die Zahl der gemeldeten Fälle zwischen 2000 und 2021 bei 4.259. Diese Zahlen können als unzureichend gemeldet gelten, da diese Krankheit im ganzen Land weiterhin vernachlässigt wird und keine aktive Suche nach Patienten mit HBV-Monoinfektion zur Bestimmung von Koinfektionen erfolgt11.

Die serologische Diagnose einer HDV-Infektion basiert auf dem Nachweis der gesamten Anti-HDV-Antikörper im Serum. Das Vorhandensein von HDAg im Lebergewebe ist auch ein klinischer Indikator, der die Bestätigung der Infektion durch Leberelastographie ermöglicht, eine nicht-invasive und schmerzlose Methode, die die Beurteilung des Grades der Leberfibrose ermöglicht4,12. Sobald Anti-HDV-Antikörper nachgewiesen werden, wird eine molekulare Diagnostik eingesetzt, um eine aktive Infektion zu bestätigen oder auszuschließen. Der molekulare Test wird durch die Suche nach HDV-RNA im Plasma durchgeführt, quantifiziert mit der RT-qPCR-Methode; Dies ist jedoch nicht üblich, da keine Kits bei der brasilianischen Gesundheitsüberwachungsbehörde (Anvisa) registriert sind. Der Einsatz molekularer Methoden zur Quantifizierung schwerer Nutzfahrzeuge in begrenzten Bereichen, in denen spezialisierte Fachleute eigene Tests entwickeln können, ist ebenfalls ein begrenzender Faktor13.

Daher bleibt die molekulare HDV-Diagnose eine Herausforderung, da sie für Endemiegebiete im Amazonasgebiet nicht allgemein verfügbar ist. Ziel der Studie war die Entwicklung eines hochempfindlichen quantitativen Multiplex-Einschritt-RT-qPCR-Assays für die Diagnose und Nachsorge von Patienten mit Hepatitis Delta.

Das Plasmid wurde in Abständen von 1 × 105 und 1,25 Kopien pro Reaktion (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 und 1,25) getestet, um die Amplifikationseffizienz und Linearität zu bestimmen. Alle Punkte auf der Quantifizierungskurve über 5 Kopien pro Reaktion zeigten in verschiedenen Tests eine 100-prozentige Amplifikation. Die Steigung des anfänglichen quantitativen Tests betrug −3,321 mit einer Effizienz von 100,04 %, einem Korrelationskoeffizienten der Geraden (R2) von 0,99 und einem Verstärkungsfaktor von 2 (siehe Abb. 1).

Quantifizierungskurve, erstellt aus linearer Regressionsanalyse von 6 Reihenverdünnungen unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids, das eine Teilregion des HDV-Ribozyms enthält, im Bereich von 5 bis 1 × 105 Kopien pro Reaktion, getestet durch RT-qPCR; Ct: Zyklusschwelle.

Die drei mit den Standardverdünnungen durchgeführten Tests wurden einzeln und gemeinsam ausgewertet und ergaben einen Variationskoeffizienten (CV%) von weniger als 10 % zwischen den Tests (Ergänzungstabelle S1). Neigungsdaten, Linienschnittpunkte, Effizienz und Korrelation zwischen Punkten sind in Tabelle 1 beschrieben.

Die Analysen der Wiederholbarkeitsdaten von Verdünnungen (1 × 105; 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 5; 2,5 und 1,25 Kopien/Reaktion) ergaben eine Quantifizierungsgrenze (LOQ) von 5 Kopien pro Reaktion ( 250 Kopien/ml) und eine Nachweisgrenze (LOD95 %) von 2,83 Kopien pro Reaktion, was 142 Kopien/ml biologischer Proben entspricht (siehe Abb. 2), was dem niedrigsten Viruslastwert entspricht, der mit dem entwickelten Assay nachgewiesen werden kann .

Die Analyse der Replikatverdünnungen (1 × 105 bis 1,25 Kopien/Reaktion) ergab für den entwickelten Assay eine Quantifizierungsgrenze (LOQ) von 5 Kopien pro Reaktion und eine Nachweisgrenze (LOD95 %) von 2,83 Kopien pro Reaktion. Für eine objektivere Visualisierung wurden Punkte über 1 × 103 nicht in die Abbildung einbezogen.

Es wurden Blutproben von 266 Patienten mit chronischer Infektion entnommen, die positiv auf Anti-HDV waren und auf Delta-Hepatitis untersucht wurden. Bei 16,54 % (44/266) wurde festgestellt, dass sie an einer Lebererkrankung litten und eine Behandlung erhielten. Davon waren 64,6 % (172/266) Männer im Alter zwischen 24 und 77 Jahren (Mittelwert 45 Jahre; Standardabweichung (SD) ± 10,23). Die Proben wurden mit dem entwickelten Assay getestet, wobei 22,93 % (61/266) eine quantifizierbare Viruslast in einem Bereich von 2,96 Kopien pro Reaktion (2,17 Log10 Kopien/ml) bis 9,01 × 105 (7,65 Log10 Kopien/ml) aufwiesen ) einer biologischen Probe (siehe Abb. 3). Insgesamt 65,57 % (40/61) der positiven Proben weisen Genotypisierungsergebnisse für HDV auf, von denen 97,5 % (39/40) als HDV-3 und 2,5 % (1/40) als HDV-1 charakterisiert werden (Ergänzungstabelle). S4).

Schematische Darstellung der Viruslast, quantifiziert für 266 Proben, die mittels RT-qPCR auf HDV getestet wurden, mit Werten in Kopien/ml (Log10) der biologischen Probe. Die gestrichelte Linie entspricht der Nachweisgrenze des Tests. Die grünen Kreise stellen positive Proben in beiden Tests dar und die blauen Kreise stellen nur positive Proben in dem in dieser Studie entwickelten Test dar. Negative Proben werden als rote Quadrate dargestellt.

Insgesamt 11,47 % (7/61) der positiven Proben waren negativ für den Referenztest14, was 2,63 % (7/266) der getesteten Proben entspricht. Im Vergleich zum Referenztest zeigte der Entwicklungstest eine Sensitivität von 100 % (95 %-KI: 93,40–100), eine Spezifität von 96,70 % (95 %-KI: 93,32–98,66) und einen positiven Vorhersagewert von 88,52 % (95 %-KI: 77,78–95,26) und 100 % (95 %-KI: 98,22–100) für den negativen Vorhersagewert, mit einer Genauigkeit von 97,37 % (95 %-KI: 94,65–98,94). Die durch die Kappa-Statistik (K) quantifizierte Interbeurteiler-Übereinstimmung betrug 0,92 (95 %-KI: 0,86–0,98), was eine gute Stärke der Übereinstimmung zwischen den Tests zeigt. Die ROC-Kurve wurde erstellt und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde mit 1,00 berechnet (Ergänzende Abbildung S2). Die abweichenden Proben hatten eine Viruslast von weniger als 7 Kopien pro Reaktion (2,96–6,07 Kopien/Reaktion), was die Unstimmigkeiten in den Testergebnissen und die niedrige Viruslast erklären könnte. Alle Proben, die negativ auf HDV und positiv auf andere Viren (DENV, SARS-CoV und HBV monoinfiziert, N = 26) waren, zeigten beim aktuellen Test negative Ergebnisse.

Hepatitis-Delta ist ein Problem der öffentlichen Gesundheit in Endemiegebieten in Südamerika. Dabei handelt es sich um eine vernachlässigte Krankheit, die gefährdete Bevölkerungsgruppen betrifft, wie zum Beispiel indigene Bewohner und Flussbewohner im Amazonasbecken5.

Generell mangelt es weltweit an Daten zum Verständnis der Epidemiologie und klinischen Merkmale. Es gibt zwei unterschiedliche Formen der Übertragung: die sogenannte Koinfektion, die durch die gleichzeitige Übertragung von HBV und HDV gekennzeichnet ist, oder sogar die Superinfektion, bei der der HDV-Übertragung die chronische Form von HBV vorausgeht4,15.

In dieser Studie wurde ein Assay entwickelt, um die Viruslast unterschiedlicher HDV-RNA mit hoher Empfindlichkeit und Effizienz zu quantifizieren. Die in der vorliegenden Studie entwickelte einstufige RT-qPCR-Technik zeigte eine gute Effizienz und Reproduzierbarkeit, was für eine höhere Präzision bei der Quantifizierung anhand einer Standardkurve von Bedeutung ist.

Die verwendete Methodik basierte auf in der Literatur beschriebenen Verfahren und respektierte quantitative internationale Standards für die molekulare Diagnose, bei denen die Abstimmung der Parameter für die Durchführung von RT-qPCR-Assays von entscheidender Bedeutung ist, um das Risiko falsch positiver und nicht schlüssiger Ergebnisse zu verringern, was die Assay-Zuverlässigkeit verringert16. 17. Der Assay erfüllt die etablierten Kriterien zur Validierung einer quantitativen qPCR, wie Effizienz, linearer dynamischer Bereich, Nachweisgrenze (LOD) und Genauigkeit, was seine Robustheit gewährleistet16.

Die aus der Steigung geschätzte Effizienz zeigte Werte nahe 100 % und einen Verstärkungsfaktor von 2, gemäß den Richtlinien zur Standardisierung von Tests, die einen Hochleistungstest mit Werten zwischen 90 und 110 % berücksichtigen16,18. Ebenso wurde der lineare dynamische Bereich mit 5 verschiedenen Konzentrationen (Log10) bestimmt, wobei mindestens 3 empfohlen werden16,19,20, zusätzlich zur Intra-Assay-Präzision (Wiederholbarkeit) und Inter-Assay-Präzision (Reproduzierbarkeit), ausgedrückt durch die Standardabweichung ( SD)-Messungen von Replikaten auf einer Standardkurve16,21,22.

Der LOD wurde als der niedrigste getestete Wert mit 5 % fehlgeschlagener Reaktionen definiert, der einen Grenzwert von 142 Kopien pro ml aufwies, was den 130 Kopien/ml in unserer vorherigen Studie ähnelt; Im aktuellen Assay ermöglicht der Assay jedoch zusätzlich zur Hinzufügung einer endogenen Kontrolle zur Überwachung der Reaktionsqualität die Durchführung von Reverse Transkription und qPCR in einer einzigen Reaktion23. Im Vergleich dazu zeigten andere Tests zur Quantifizierung von HDV-RNA eine Nachweisgrenze im Bereich von 15 bis 750 Kopien/ml24,25,26.

Bei den Experimenten an Patientenproben wurde eine Verbesserung der Quantifizierung von HDV-RNA durch die Anwendung des Hitzeschockschritts vor dem Reverse-Transkriptionsschritt beobachtet. Das gleiche Ergebnis wurde in einer Studie beobachtet, in der die Wirkung eines Schocks in seriell verdünnten klinischen Proben untersucht wurde27. Dies könnte durch die Natur des HDV-Genoms erklärt werden, das ein hohes G/C-Verhältnis aufweist und eine interne Basenpaarung von etwa 70 %2 ermöglicht.

In dieser Studie haben wir uns für die Verwendung eines rekombinanten Plasmids als Assay-Quantifizierungsstandard entschieden, das eine Konsenssequenz der 8 HDV-Genotypen darstellt, wobei zu berücksichtigen ist, dass in der Amazonasregion die Genotypen 310, 28, 29 vorherrschen, und der von festgelegte Standard Die WHO für die HDV-Quantifizierung leitet sich vom Genotyp 130 ab. Ebenso wurden die bei der Standardisierung verwendeten Primer so konzipiert, dass sie eine konservierte Region für die 8 Virus-Genotypen erkennen und so die Sensitivität und Spezifität des Tests gewährleisten. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass das mit einem partiellen HDV-Genom erstellte Muster trotz seiner praktischen Anwendung seine Grenzen hat, da es sich nicht um eine echte biologische Probe handelt. Wir haben jedoch das Plasmid verdünnt in einer Matrix aus Nukleinsäuren verwendet, die aus einer negativen Probe extrahiert wurden zu HDV, um eine biologische Probe nachzuahmen.

Die Ergebnisse von 7 Proben, die zwischen dem aktuellen Test und dem Referenztest nicht übereinstimmten, lassen sich durch die Grenzwerte zur Quantifizierung erklären, der Vergleich beschränkte sich jedoch nur auf qualitative Ergebnisse, da es unterschiedliche Maßeinheiten für die Quantifizierung gibt. Darüber hinaus wird die Möglichkeit möglicher falsch positiver Ergebnisse durch die Tatsache ausgeschlossen, dass alle in diese Analyse einbezogenen Patienten serologisch positiv (Anti-HDV) sind. Darüber hinaus erhielten die meisten Patienten in dieser Studie eine Therapie gegen Hepatitis Delta, was die Tatsache rechtfertigt, dass trotz der positiven HDV-Serologie nicht alle von ihnen eine quantifizierbare Viruslast aufwiesen, wie in beiden durchgeführten Tests beobachtet.

Beim HDV-Nachweis kann die Diagnose sowohl durch den Nachweis von Anti-HDV-Antikörpern als auch durch die Suche nach direkten Markern wie dem HDV-Antigen und durch den Nachweis des zirkulierenden viralen Genoms gestellt werden15,31. Eine der Haupteinschränkungen bei der Diagnose von HDV mithilfe serologischer Methoden besteht darin, dass die aktuelle Infektion nicht aufgeklärt werden kann und sich auf einen Marker für den Kontakt mit dem Virus beschränkt, der sich von dem unterscheidet, was bei HBV auftritt und bei dem die verschiedenen Stadien bestimmt werden können diese Krankheit32. In diesem Fall kann die Verwendung eines quantitativen Tests zum Verständnis der verschiedenen Stadien einer HDV-Infektion beitragen.

Die serologische Diagnose wird in Brasilien nicht weit verbreitet, was es schwierig macht, die tatsächliche Prävalenz von HDV in diesem Land zu ermitteln. Es ist wichtig, das Bewusstsein und die Bemühungen der Gesundheitsbehörden und der Bevölkerung für die Bedeutung der serologischen Diagnose zu schärfen. Gemäß einer Empfehlung einer Leitlinie zur Diagnose viraler Hepatitis in Brasilien sollte Hepatitis Delta bei Personen untersucht werden, die in Immunoassays auf HBsAg reaktive Ergebnisse zeigen und die in Endemiegebieten dieser Erkrankung wohnen oder sich dort aufgehalten haben33.

Nach Angaben der WHO ist die Verfügbarkeit der HDV-Diagnose immer noch begrenzt und es fehlen direkte HDV-RNA-Nachweismethoden, die normalerweise zur Überwachung des Ansprechens auf eine antivirale Therapie verwendet werden34. Wie bei HBV und HIV ermöglichte die Standardisierung der Labordiagnose durch Echtzeit-PCR erhebliche Fortschritte im klinischen Protokoll und in den Therapierichtlinien für eine angemessene Behandlung und Kontrolle, wobei spezifischere Ansätze auf Patienten zugeschnitten waren35. Die Ausweitung der diagnostischen Abdeckung für HDV in Brasilien würde die Ausarbeitung von Leitlinien für die spezifische Behandlung und den diagnostischen Algorithmus (zur Identifizierung in Verdachtsfällen) ermöglichen und so das Risiko einer Entwicklung mit einer Remission akuter und chronischer Leberaktivitäten (Abnahme von Manifestationen und nekroinflammatorischen Erkrankungen) verringern Aktivitäten, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom)36.

In diesem frühen Jahrzehnt beschäftigten sich Forscher noch mit der Frage, wie man eine zufriedenstellende Behandlung für Patienten mit chronischer HDV-Infektion etablieren kann, obwohl die aktuelle Therapie mit Peg-IFN (pegyliertes Interferon) seit etwa 35 Jahren medizinisch verfügbar ist32,37. Die bestehenden Hindernisse in Bezug auf die Wirksamkeit der Behandlung von HDV hängen mit der direkten Abhängigkeit von der Verschreibung von Therapien zur Behandlung von HBV bei infizierten Personen zusammen. Daher ist der therapeutische Ansatz an die zirkulierenden HBsAg-Spiegel gebunden, basierend auf internationalen Richtlinien, die die Behandlung von Medikamenten bei Personen mit HDV nur dann vorschreiben, wenn sie in der klinischen Nachuntersuchung eine Viruslast für HBV > 2.000 IE/ml aufweisen38,39 . In diesem Fall ermöglicht die Anwendung eines quantitativen RT-qPCR-Assays zum HDV-Nachweis die Identifizierung, Quantifizierung und Überwachung der Virusreplikation im Krankheitsverlauf bei Patienten.

Zusätzlich zu einer genauen serologischen und quantitativen molekularen Diagnose für HDV ist es notwendig, das Bewusstsein der Gesundheitsbehörden und Regierungen für dieses Thema zu schärfen, mit besonderem Augenmerk auf Länder mit einer hohen Anzahl bestätigter Fälle. Impfprogramme gegen HBV, aber auch die Kartierung von HDV-Endemiegebieten, die Verfolgung von Fällen und die Bereitstellung einer angemessenen Behandlung von HDV-Fällen könnten nützlich sein, um eine zukünftige Übertragung zu verhindern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser aktuelle Test eine hohe Effizienz und Reproduzierbarkeit gezeigt hat, was ihn zu einem wertvollen Instrument zur Überwachung von HDV-Trägern und zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs sowie der Wirksamkeit der Behandlung macht. Darüber hinaus könnte dieser Test Studien ermöglichen, die Viruslast und die Persistenz von chronischem HDV in Zusammenhang zu bringen, was ein höheres Risiko für die Entwicklung einer Leberzirrhose und eines hepatozellulären Karzinoms mit sich bringt.

Diese Studie wurde von der Forschungsethikkommission des Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia – CEPEM/RO (Nr. 3.826.726) genehmigt und die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt. Die Forschungsverfahren wurden gemäß den ethischen Grundsätzen der Weltärzteversammlung von 1975 und des brasilianischen Gesundheitsministeriums durchgeführt und folgen den in der Resolution Nr. 466 vom 12. Dezember 2012 festgelegten Normen.

Querschnittsforschung wurde am Laboratório de Virologia Molecular da Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – FIOCRUZ/RO und am Centro de Infectologia Charles Merieux & Laboratório Rodolphe Merieux (FUNDHACRE) entwickelt. Blutproben von Patienten wurden im Zeitraum zwischen 2017 und 2023 im Ambulatório Especializado em Hepatites Virais bei CEPEM-RO und Serviço de Assistência Especializada (SAE-SESACRE) entnommen. Es wurden zwei Gruppen von Patienten untersucht: HDV-Träger mit vorheriger ELISA-Diagnose (positiv gegenüber Anti-HDV, HBsAg und Anti-HBc-Total; n = 266); und eine zweite Gruppe, die mit einigen anderen Viren (n = 26), HBV (16/26), DENV (5/26) und SARS-CoV-2 (5/26) infiziert ist, ohne Anzeichen einer HDV-Infektion (Negativ bis Anti-Virus). HDV). Klinische und Laboruntersuchungsinformationen wurden aus Krankenakten gesammelt.

Die Nukleinsäure wurde mithilfe der Magnetkügelchen-Methode extrahiert, gefolgt von einem automatischen Extraktor EXTRACTA 32 DNA- und RNA-Extraktor (LOCCUS, São Paulo, Brasilien) und einem Reiniger mit EXTRACTA KIT FAST – Viral DNA/RNA (MVXA-P016FAST) gemäß den Anweisungen des Herstellers eluiert in 50 µL Elutionspuffer.

Um den Quantifizierungsstandard zu erstellen, wurden Referenzsequenzen für die verschiedenen HDV-Genotypen ausgewählt, die in der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) hinterlegt sind. Die Sequenzen wurden mithilfe des ClustalW-Algorithmus (Molecular Evolutionary Genetics Analysis – MEGA, Version 11)40 ausgerichtet. Nach dem Alignment wurde eine Konsenssequenz von 1014 Basenpaaren (bp) konstruiert, die allen 8 Genotypen entspricht. Die ausgewählte Region umfasst teilweise das vollständige HDV-Genom (Anfangsposition 675 und Endposition 1682; NCBI-Referenzsequenz: NC_001653.2), einschließlich der kurzen, langen, Ribozym- und nichtkodierenden Regionen (NTR) des viralen Antigens (HDVAg). Das Insert wurde kommerziell synthetisiert und in den Vektor pUC57 (Genscript Biotech Corporation, New Jersey, USA) kloniert, wodurch ein rekombinantes Plasmid mit einer Größe von 3724 Basenpaaren entstand (Ergänzende Abbildung S3).

Die Plasmidkonzentration in ng/μL wurde durch Fluorimetrie unter Verwendung des Qubit 4 dsDNA High Sensitivity Kits (ThermoFisher Scientific®, Massachusetts, USA) bestimmt und die anfängliche Kopienzahl von 2,12 × 108 wurde basierend auf der rekombinanten DNA-Größe und dem Molekulargewicht berechnet zur zuvor beschriebenen Methode41, basierend auf der folgenden Gleichung. (1):

Das rekombinante Plasmid wurde in einer biologischen Matrix aus Nukleinsäuren, die aus Hepatitis-Delta-negativem Humanserum extrahiert wurden, in den folgenden Konzentrationen seriell verdünnt: 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 1 × 100; 0,5 e 0,125 Kopien pro Mikroliter zur gleichzeitigen Amplifikation des viralen Ziels (HDV) und der menschlichen endogenen Kontrolle (RNase P).

Zur Quantifizierung von HDV-RNA wurden Primer und Sonden entwickelt, um die hochkonservierte Ribozym-Region nachzuweisen, wie in der ergänzenden Abbildung S3 zu sehen ist. Um die Sekundärstrukturen des HDV-Genoms zu zerstören, wurde aus biologischen Proben extrahiertes genetisches Material 5 Minuten lang bei 95 °C und anschließend 1 Minute lang auf Eis inkubiert. Die Multiplex-Reaktion wurde unter Verwendung von 5 µL TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems®, Kalifornien, USA), 10 µL jeder Kurvenverdünnung oder genetischem Material aus einer biologischen Probe und 5 µL Oligomix mit 300 nM jedes Primers standardisiert und 100 nM für die HDV-Sonde und 500 nM für jeden Primer und 125 nM für die Sonde zum Nachweis der endogenen Kontrolle (Tabelle 2).

Die Reaktion wurde auf einem QuantStudio™ 7 Pro Real Time PCR System unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 50 °C für 30 Minuten für die reverse Transkription und 95 °C für 15 Minuten für die PCR-Aktivierung, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden und 63 Sekunden °C für 30 s, wobei die Fluoreszenz erfasst wurde. Die Daten wurden in Software Design & Analysis Version: 2.6.0 analysiert, wobei für beide Ziele ein Basiswert von 3–15 und ein Schwellenwert von 0,1 verwendet wurden.

Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit wurden anhand von drei Tests gemessen, die an aufeinanderfolgenden Tagen von verschiedenen Bedienern durchgeführt wurden. Die Punkte mit 1 × 105; 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 5; Für jeden Tag wurden 2,5 und 1,25 Kopien/Reaktion in technischen Oktuplikaten verwendet. Die analytische Sensitivität wurde anhand von Wiederholbarkeitsdaten bestimmt, die als Grundlage für die Messung der Nachweisgrenze (LOD95 %) dienten.

Um die diagnostische Sensitivität zu bestimmen, wurden die biologischen Proben einem Test zur HDV-RNA-Quantifizierung unterzogen. Alle getesteten Proben wurden einem zweiten kommerziellen quantitativen RT-qPCR-Test (RealStar® HDV RT-PCR Kit 1.0; Altona Diagnostics, Hamburg, Deutschland) als Referenz14 unterzogen und mit den erhaltenen Daten verglichen. Positive Proben für andere Viren und negative für HDV (DENV, SARS-CoV und monoinfiziertes HBV) wurden mit dem zur Abschätzung der diagnostischen Spezifität entwickelten Assay getestet.

Deskriptive Analysen wurden durch Häufigkeiten, zentrale Tendenz und Streuung dargestellt. Die Standardkurve wurde mit der Software R v4.2.144 erstellt und zur Berechnung der Nachweisgrenze (LOD95 %) wurden die analytischen Sensitivitätsdaten einer binomialen Regressionsanalyse unter Verwendung des statistischen Probit-Modells unterzogen. Die Ergebnisse der diagnostischen Sensitivität und Spezifität wurden verwendet, um die Werte für Sensitivität, Spezifität, positiven Vorhersagewert, negativen Vorhersagewert, Kappa-Übereinstimmungsindex und die Konstruktion der ROC-Kurve unter Verwendung eines Referenzassays abzuschätzen14.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Taylor, JM Infektion durch Hepatitis-Delta-Virus. Viren 12, 648 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caviglia, GP, Ciancio, A. & Rizzetto, M. Ein Überblick über HDV-Infektionen. Viren 14, 1749 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weltgesundheitsorganisation. Hepatitis. https://www.who.int/health-topics/hepatitis#tab=tab_2.

Hughes, SA, Wedemeyer, H. & Harrison, PM Hepatitis-Delta-Virus. The Lancet 378, 73–85 (2011).

Artikel Google Scholar

Cabezas, C. & Braga, W. Hepatitis-B-Virus und Delta-Infektion: Besondere Überlegungen bei den einheimischen und isolierten Flussuferpopulationen im Amazonasgebiet. Klin. Leber Dis. (Hoboken) 16, 117–122 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Stockdale, AJ et al. Die weltweite Prävalenz der Hepatitis-D-Virusinfektion: Systematische Überprüfung und Metaanalyse. J. Hepatol. 73, 523–532 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Farci, P. Delta-Hepatitis: Ein Update. J. Hepatol. 39, 212–219 (2003).

Artikel Google Scholar

di Filippo Villa, D. et al. Hepatitis-D-Virus- und Hepatitis-B-Virusinfektion in indianischen Gemeinden im Bundesstaat Amazonas, Kolumbien. Virol. J. 12, 172 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Duarte, MC et al. Eine vergleichende epidemiologische Studie zu Hepatitis-B- und Hepatitis-D-Virusinfektionen bei Yanomami- und Piaroa-Indianern im Bundesstaat Amazonas, Venezuela. Trop. Med. Int. Gesundheit 15, 924–933 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Casey, JL et al. Hepatitis-B-Virus (HBV)/Hepatitis-D-Virus (HDV)-Koinfektion bei Ausbrüchen akuter Hepatitis im peruanischen Amazonasbecken: Die Rolle von HDV-Genotyp III und HBV-Genotyp FJ Infect. Dis. 174, 920–926 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gesundheitsministerium. Epidemiologisches Bulletin zur Virushepatitis – Sonderausgabe | Juni 2022. https://www.gov.br/saude/pt-br/centrais-de-conteudo/publicacoes/boletins/epidemiologicos/especiais/2022/boletim-epidemiologico-de-hepatites-virais-2022-numero-especial/view.

Negro, F. & Rizzetto, M. Diagnose einer Hepatitis-Delta-Virus-Infektion. J. Hepatol. 22, 136–139 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Coller, KE et al. Entwicklung und Durchführung von Prototypen serologischer und molekularer Tests für Hepatitis-Delta-Infektionen. Wissenschaft. Rep. 8, 2095 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Helge, M., Annika, L., Alan, V. & Elsbeth, P.-M. Ein neuartiges Echtzeit-RT-PCR-Testkit zum Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatitis-D-Virus (HDV). (2017).

Farci, P. & Niro, G. Klinische Merkmale der Hepatitis D. Semin. Leber Dis. 32, 228–236 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Bustin, SA et al. Die MIQE-Richtlinien: Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente. Klin. Chem. 55, 611–622 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kralik, P. & Ricchi, M. Ein grundlegender Leitfaden zur Echtzeit-PCR in der mikrobiellen Diagnostik: Definitionen, Parameter und alles. Vorderseite. Mikrobiol. 8, 108 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bustin, AS et al. Der Bedarf an Transparenz und bewährten Praktiken in der qPCR-Literatur. Nat. Methoden 10, 1063–1067 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Taylor, SC & Mrkusich, EM Der Stand der RT-quantitativen PCR: Beobachtungen aus erster Hand zur Umsetzung von Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE). Mikrob. Physiol. 24, 46–52 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Bustin, SA Absolute Quantifizierung von mRNA mithilfe von Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionstests. J. Mol. Endokrinol. 25, 169–193 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parker, J. et al. Analytischer Empfindlichkeitsvergleich zwischen Singleplex-Echtzeit-PCR und einer Multiplex-PCR-Plattform zum Nachweis von Atemwegsviren. PLoS ONE 10, 1–9 (2015).

Artikel Google Scholar

Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M. & Nguyen, M. Ein praktischer Ansatz zur RT-qPCR-Veröffentlichung von Daten, die den MIQE-Richtlinien entsprechen. Methoden 50, S1 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Botelho-Souza, LF et al. Entwicklung eines quantitativen Echtzeit-PCR-basierten Reverse-Transkriptions-Systems zum schnellen Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatitis-Delta-Virus in der westlichen Amazonasregion Brasiliens. J. Virol. Methoden 197, 19–24 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yamashiro, T. et al. Quantifizierung des Gehalts an Hepatitis-Delta-Virus-RNA im Serum durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion – und ihre mögliche Korrelation mit dem klinischen Stadium der Lebererkrankung. J. Infizieren. Dis. 189, 1151–1157 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

le Gal, F. et al. Die Quantifizierung der Hepatitis-Delta-Virus-RNA im Serum durch Konsens-Echtzeit-PCR weist auf unterschiedliche Muster der virologischen Reaktion auf die Interferontherapie bei chronisch infizierten Patienten hin. J. Clin. Mikrobiol. 43, 2363–2369 (2005).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mederacke, I. et al. Etablierung eines neuartigen quantitativen Hepatitis-D-Virus (HDV)-RNA-Assays unter Verwendung der Cobas-Taqman-Plattform zur Untersuchung der HDV-RNA-Kinetik. J. Clin. Mikrobiol. 48, 2022–2029 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Homs, M. et al. Relevanz eines genomischen RNA-Standards voller Länge und eines Thermoschockschritts für eine optimale Quantifizierung des Hepatitis-Delta-Virus. J. Clin. Mikrobiol. 52, 3334–3338 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melo Da Silva, E. et al. Eine Non-F-HBV/HDV-3-Koinfektion ist im westbrasilianischen Amazonasgebiet mit schwerer Lebererkrankung verbunden. J. Med. Virol. 91, 1081–1086 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakano, T. et al. Charakterisierung des Hepatitis-D-Virus-Genotyps III bei Yucpa-Indianern in Venezuela. J. General Virol. 82, 2183–2189 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paul-Ehrlich-Institut. 1. Internationaler Standard der Weltgesundheitsorganisation für Hepatitis-D-Virus-RNA für auf Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) basierende Tests – PEI-Code 7657/12. https://www.pei.de/SharedDocs/Downloads/EN/regulation-en/referencematerial/7657-12-ifu.html (2018).

Ciancio, A. & Rizzetto, M. Chronische Hepatitis D im Stillstand: Wohin gehen wir von hier aus? Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 68–71 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Niro, GA, Ferro, A., Cicerchia, F., Brascugli, I. & Durazzo, M. Hepatitis-Delta-Virus: Von der Infektion zu neuen Therapiestrategien. Welt J. Gastroenterol. 27, 3530–3542 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gesundheitsministerium. Technisches Handbuch zur Diagnose von Virushepatitis – Abteilung für HIV/Aids, Tuberkulose, Virushepatitis und sexuell übertragbare Infektionen. https://www.gov.br/aids/pt-br/centrais-de-conteudo/publicacoes/2018/manual_tecnico_hepatites_virais_web_3108181.pdf/view (2022).

Weltgesundheitsorganisation. Hepatitis D. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-d (2022).

Price, J. Ein Update zu Hepatitis B-, D- und E-Viren. Spitze. Antivir. Med. 21, 157–163 (2014).

PubMed Google Scholar

Gesundheitsministerium. Klinisches Protokoll und Therapierichtlinien für Hepatitis B und Koinfektionen – Abteilung für HIV/AIDS, Tuberkulose, Virushepatitis und sexuell übertragbare Infektionen. https://www.gov.br/aids/pt-br/centrais-de-conteudo/pcdts/2016/hepatites-virais/pcdt_hepatite_b_270917.pdf/view (2017).

Zi, J. et al. Mehrere Regionen fördern die Verbreitung des Hepatitis-Delta-Virus und sind therapeutische Ziele. Vorderseite. Mikrobiol. 13, (2022).

Terrault, NA et al. Update zur Prävention, Diagnose und Behandlung chronischer Hepatitis B: AASLD 2018 Hepatitis B-Leitfaden. Hepatology 67, 1560–1599 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Lange, M., Zaret, D. & Kushner, T. Hepatitis Delta: Aktuelles Wissen und zukünftige Richtungen. Gastroenterol. Hepatol. (NY) 18, 508–520 (2022).

PubMed Google Scholar

Tamura, K., Stecher, G. & Kumar, S. MEGA11: Molekulare Evolutionsgenetische Analyse Version 11. Mol. Biol. Entwicklung 38, 3022–3027 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Whelan, JA, Russell, NB & Whelan, MA Eine Methode zur absoluten Quantifizierung von cDNA mittels Echtzeit-PCR. J. Immunol. Methoden 278, 261–269 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pacin-Ruiz, B. et al. Untersuchung der Ribozymregion des Hepatitis-Delta-Virus-Genotyps 1: Konservierung und Variabilität. Viren 14, 215 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nationales Zentrum für Immunisierung und Atemwegserkrankungen (USA). 2019-neues Coronavirus (2019-nCoV) Echtzeit-rRT-PCR-Panel-Primer und -Sonden. Vorabdruck unter https://stacks.cdc.gov/view/cdc/84525 (2020).

R-Kernteam. R: Eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen. Vorabdruck unter https://www.r-project.org/ (2018).

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde von der Forschergruppe des Labors für Molekulare Virologie der Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – FIOCRUZ/RO zusammen mit dem Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia – CEPEM/RO und dem Secretaria de Estado da Saúde de Rondônia – SESAU entwickelt /RO, Nationales Institut für Wissenschaft und Technologie der Epidemiologie des westlichen Amazonas – INCT/EpiAmo und die Rondônia-Stiftung zur Unterstützung der Entwicklung wissenschaftlicher und technologischer Maßnahmen und Forschung im Bundesstaat Rondônia – FAPERO (Prozess: VPPIS-003-FIO - 20.2.75; INNOVATION IM AMAZONAS). Zusammenarbeit mit dem Specialized Assistance Service (SAE-SESACRE), der Fundação Estadual Hospitalar do Acre (FUNDHACRE), der Fundação Maria Emília, der Fondation Merieux, der Koordinierung der persönlichen Weiterentwicklung im Hochschulbereich – CAPES und der Koordinierung der Gesundheitsüberwachung und Referenzlaboratorien – CVSLR/FIOCRUZ wesentlich für die Entwicklung der Studie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jackson Alves da Silva Queiroz und Tárcio Peixoto Roca.

Fundação Oswaldo Cruz Rondônia FIOCRUZ/RO, Rua da Beira, 7176, Porto Velho, 76812-245, Brasilien

Jackson Alves da Silva Queiroz, Tárcio Peixoto Roca, Ana Maísa Passos-Silva, André Luiz Ferreira da Silva, Soraya dos Santos Pereira und Deusilene Vieira

Postgraduiertenprogramm in Experimentalbiologie, Federal University of Rondônia und Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – UNIR/FIOCRUZ/RO, 76801-974, Porto Velho, Brasilien

Jackson Alves da Silva Queiroz, Ana Maísa Passos-Silva, André Luiz Ferreira da Silva, Soraya dos Santos Pereira und Deusilene Vieira

Postgraduiertenprogramm in Tropenmedizin, Instituto Oswaldo Cruz/IOC, FIOCRUZ, 21041-250, Rio de Janeiro, Brasilien

Tárcio Peixoto Roca, Luiz Fellype Alves de Souza, Eugênia de Castro e Silva und Lívia Melo Villar

Charles Merieux Infectology Center & Rodolphe Merieux Laboratory (FUNDHACRE), Rio Branco, 69918-340, Brasilien

Rutilene Barbosa Souza, Luiz Fellype Alves de Souza und Daniel Archimedes da Matta

Federal University of Bahia – UFBA, Salvador, 40110-909, Brasilien

Rutilen Barbosa Souza

Forschungszentrum für Tropenmedizin – CEPEM, Porto Velho, 76812-329, Brasilien

Eugênia de Castro e Silva & Lourdes Maria Pinheiro Borzacov

Institut für Molekularbiologie von Paraná – IBMP, 81350-010, Curitiba, Brasilien

Rita de Cássia Pontello Rampazzo

Federal University of Acre – UFCC, Rio Branco, 69915-900, Brasilien

Thor Oliveira Dantas

Acre Central Public Health Laboratory – LACEN/AC, Rio Branco, 69900-614, Brasilien

Janaína Mazaro

Federal University of Rondônia – UNIR, Porto Velho, 76801-974, Brasilien

Juan Miguel Villalobos Salcedo

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung: JASQ, TPR, DV; Molekulare Assays: JASQ, TPR, RBS, LFAS; Auswahl der Paneldatenbeispiele: JASQ, TPR, RBS, LFAS; Medizinischer Ansatz: ECS, LMPB, TOD, JMVS; Datenkuration: JASQ, TPR; Formale Analyse: JASQ, TPR; Finanzierungseinwerbung: JMVS, DV, DAM; Untersuchung: JASQ, TPR, RBS; Methodik: JASQ, TPR, RCPR, SSP, JM, LMV; Projektverwaltung: DV; Betreuung: DV; Schreiben – Originalentwurf: JASQ, TPR, RBS, LFAS, AMPS, ALFS, SSP; Schreiben–Überprüfen und Bearbeiten: RCPR, DAM, DV Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Deusilene Vieira.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

da Silva Queiroz, JA, Roca, TP, Souza, RB et al. Entwicklung eines quantitativen Multiplex-RT-qPCR-Einschritt-Assays zum Nachweis des Hepatitis-Delta-Virus. Sci Rep 13, 12073 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37756-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. April 2023

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 26. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37756-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.